糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，是许多生物制药的关键产品。蛋白质糖基化，作为最常见和最复杂的翻译后修饰之一，对调控多种生物过程至关重要。因此，识别糖蛋白的糖基化位点及相关聚糖结构，对于其功能研究显得尤为重要。液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已成为一种有效的工具，广泛应用于蛋白质鉴定和翻译后修饰的发现。

与糖蛋白质组学常用的数据库搜索策略不同，蛋白质从头测序作为一种新方法，无需预先了解DNA或氨基酸序列。然而，糖基化位点的复杂性常常导致序列覆盖不足，以及游离寡糖修饰谱不明，这使得获得详尽的糖肽碎裂谱并支撑从头测序变得困难。广泛的糖基化可能导致某些区域出现间隙，从而限制了从头测序在拥有一致结构和已知N型糖基化位点的单克隆抗体(mAb)中的应用。

在2025年发表的“通过综合质谱基础的从头测序策略解码蛋白质糖基化”论文中，阐述了如何利用这种方法识别未知糖蛋白。这项研究绿化了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的特征相结合的方法，使得全面的序列覆盖成为可能。借助N-/O-糖的去糖基化，研究者能够获得高质量长肽，并促进确切的蛋白质组装。此外，该方法已成功应用于复杂糖基化的融合蛋白——依那西普，以及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂，显示出一级序列中的细微差异。

为了提高N/O-糖基化修饰的识别，作者采用了一系列研究方法。首先使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶以确保去糖基化的效果，通过全面质量分析确认这一点。利用电子转移高能碰撞解离（EThcD）获取高质量的肽段，并采用PEAKSAB进行序列分析。其次，使用含18O的环境，PNGaseF酶解将糖基化Asn转化为Asp并标记18O，从而定量分析N糖基化位点。最后，将样本处理与内切糖苷酶混合物结合，分析质谱数据，验证N-糖基化位点的成果。

这项研究展示了糖蛋白从头测序的新方法，尤其是针对高度糖基化的生物药物依那西普和三种新的TNFR：Fc融合生物制剂的有效应用。通过全面分析这些生物药物的糖基化特征，研究人员揭示了一级序列的微小差异，确认了糖基化位点，提高了生物医药产品的准确性和有效性。

总之，这一新策略的成功应用，不仅为深入了解高度糖基化蛋白质开辟了新的路径，也为生物制药领域提供了强大的技术支持。这也再次证明了人生就是博-尊龙凯时在生物医疗研究中的重要价值，推动了对多种疾病的治疗进程。