细胞融合方法主要包括物理法、化学法及生物法等。其中，物理法如电融合和激光融合，化学法则以聚乙二醇（PEG）融合法为代表。此外，还有使用灭活仙台病毒的生物法。PEG是一种在分子量200～700时呈无色、无臭粘稠液体，而分子量大于1000时则呈乳白色蜡状固体，能够溶于水及多种有机溶剂，且在热稳定性方面表现良好。一般选用分子量为4000的PEG作为细胞融合剂，常用浓度为50%，pH范围在80～82（可通过10% NaHCO3调整）。较小分子量的PEG会导致融合效果不佳，且存在一定毒性，而过大的分子量则使得操作不便。研究发现，50%的PEG浓度和偏碱性pH条件下的融合效果最佳。为了改善融合效果，有时还会结合使用30%～50%浓度的PEG和10%二甲亚砜。然而，不同批次的PEG，即便分子量相同，融合率也可能存在显著差异，因此在选用时需特别注意，并确保在每批试剂使用前均进行细胞毒性测试。此外，购入时应选择高纯度的PEG，通常以气相色谱用PEG为最佳选择。

在融合方法上，常用的有转动法和离心法。在细胞融合过程中，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例可为1:1至10:1，其中3:1或5:1的比例最为常见。

人生就是博-尊龙凯时，以下是实验所需的试剂与材料：

(1) 脾细胞及骨髓瘤细胞；

(2) 1640培养液100ml；

(3) 完全1640液100ml；

(4) 25% FCS-1640液50ml；

(5) HAT培养液100ml；

(6) 50% PEG：高纯度分子量4000的PEG（日本进口或Serva）10g，放入25ml瓶中高压灭菌，使用前混合等量的预热于40℃的1640液10ml；

(7) 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶；

(8) 40孔塑料培养盘。

操作步骤如下：

1. 准备好脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml的25% FCS-1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 移除上清液。
5. 轻敲沉淀管底部，使沉淀松散，然后将沉淀管放置在40℃水浴中，达到融合温度。
6. 加入预热至40℃的50% PEG 0.8ml，并用1ml吸管逐滴加入，同时轻轻摇动沉淀管，观察到颗粒出现，滴加时间约为2分钟。
7. 加入1ml 1640液，并继续摇动，持续1分钟。
8. 重复第7步一次。
9. 再次加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
10. 再重复第9步一次。
11. 加入15ml 1640液。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 去掉上清液，轻敲管底部，加入25ml的含有HAT的完全1640液。
14. 向已经种有饲养细胞的40孔培养盘中加入融合的细胞液，每孔一滴（约0.05ml）。
15. 轻摇后，放入5% CO2饱和湿度的37℃恒温箱中培养。
16. 在第3、6、9、10天更换为含HAT的完全1640培养液。在更换液体时注意温和吸取上清，避免吸出固定在孔底的细胞，并根据需要加入适量的饲养细胞。
17. 在第12、15天再次添加含HAT的完全1640培养液。每次换液之前使用倒置显微镜观察，通常在10天左右可见杂交瘤细胞的生长，大部分细胞将在10日至20天内出现，但也有一些可能在一个月后才逐渐显现。出现杂交瘤细胞后应吸取上清液以检查抗体。
18. 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，可视情况取消HAT液和完全1640液，更换为10% FCS-1640液。同时进行液氮保存和克隆化，每代都需检查抗体，以防止抗体细胞的变异和丢失。

在进行细胞融合的过程中，有几个关键因素需要关注：

(1) 技术误差常常导致融合失败，例如供体淋巴细胞未能引发免疫应答，这可能导致实验失败；

(2) 融合实验的一大失败原因是污染，因此在实验操作中必须提供一个无污染且无菌的环境。

人生就是博-尊龙凯时，致力于提供卓越的生物医疗解决方案，助力科学研究的每一步。